چهارشنبه ۱۳ تیر ۹۷ ۱۱:۳۰ ۱۲۹ بازديد
سراشيا مارسه سنس يك باسيل گرم منفي از خانواده بزرگ انتروباكترياسه مي‌باشد، كه با توجه به توليد سه آنزيم خاص شامل DNAase، Lipase و gelatinase از ساير گونه‌ها تشخيص داده مي‌شود
مشخصات فايل
| تعداد صفحات | 141 |
| حجم | 7 كيلوبايت |
| فرمت فايل اصلي | doc |
| دسته بندي | پزشكي |
توضيحات كامل
رساله دكتراي رشته پزشكي با عنوان توليد، خالص‌سازي، تعيين ساختمان و بررسي اثرات سميت سلولي پيگمان توليد شده توسط سويه سراشيا مارسه‌سنس PTCC 1111
خلاصه فارسي :
سراشيا مارسه سنس يك باسيل گرم منفي از خانواده بزرگ انتروباكترياسه مي‌باشد، كه با توجه به توليد سه آنزيم خاص شامل DNAase، Lipase و gelatinase از ساير گونه‌ها تشخيص داده مي‌شود. ويژگي ديگر اين باكتري توليد يك پيگمان قرمز رنگ درون سلولي به نام prodigiosin مي‌باشد. اين پيگمان به دليل داشتن اثرات ضدقارچي، ضد باكتريايي و ضد پروتوزوآيي به عنوان يك داروي پر آتيه مطرح مي‌باشد. امروزه انواع بدخيمي‌ها و سرطان‌ها از علل شايع مرگ و مير در سراسر دنيا مي‌باشند كه درمان آنها نيز تا به حال موفقيت آميز نبوده است. يكي از مشكلات علم پزشكي شكست دارو درماني در درمان سرطان است، اين شكست مي‌تواند به دليل عدم تحمل دارو از طرف بيمار، عوارض شيمي درماني و يا بروز مقاومت دارويي باشد.
بر اين اساس و همچنين به علت پيامدهاي اجتماعي سرطان، جامعه پزشكي امروزه به دنبال شناسايي تارگت‌هاي جديد و تركيباتي با سميت كمتر و اثر بخشي بيشتر نسبت به عوامل شيمي درماني كه در حال حاضر استفاده مي‌شود مي‌باشند و از آنجايي كه با استفاده از ميكروارگانيسم‌ها مي‌توان به داروهاي ضد سرطان با اثرات اختصاصي‌تر و سميت كمتر براي انسان دست يافت كه روش‌هاي توليد آنها نيز مقرون به صرفه مي‌باشد، لذا هدف از اين پايان نامه توليد، خالص‌سازي، تعيين ساختمان و بررسي اثرات سميت سلولي پيگمان توليد شده توسط سويه سراشيا مارسه‌سنس PTCC 1111 مي‌باشد.
به منظور توليد پيگمان، باكتري در محيط نوترينت براث كشت داده شد و به مدت 5 روز در دماي 28، گرمخانه گذاري گرديد. سپس محيط كشت سانتريفوژ شد و پيگمان با استفاده از اتانول اسيدي از داخل سلول‌ها استخراج گرديد. به منظور خالص‌سازي پيگمان از كروماتوگرافي ستوني استفاده شد. با استفاده از طيف و LC/MS مشخص شد كه اين پيگمان يك تركيب تري پيرولي با اسكلت pyrrolypyrromethen و يك گروه متوكسي در موقعيت 4 و وزن مولكولي Da 323 مي‌باشد.آزمايشات سميت سلولي بر روي دو رده سلولي HT29 و T47D با استفاده از آزمون MTT انجام شد و مشخص شد كه Prodigiosin بر روي هر دو رده سلولي HT29 و T47D اثر مهار كنندگي رشد قابل قبولي داشته كه اين اثر مهاركنندگي، اثري وابسته به غلظت و زمان بوده و با افزايش غلظت و مدت زمان مجاورت، اين اثر افزايش مي‌يابد. لازم به ذكر است كه اثر مهار كنندگي رشد prodigiosin بر روي سلول‌هاي HT29 به طور مشهودي بيشتر از سلول‌هاي T47D بوده است. با توجه به نتايج به دست آمده چنين به نظر مي‌رسد كه prodigiosin اين پتانسيل را دارد كه براي طراحي داروهاي ضد سرطان جديد مورد مطالعه قرار گيرد.
كلمات كليدي:
پيگمان
سرطان
prodigiosin
سميت سلولي
محيط نوترينت براث
كروماتوگرافي ستوني
سويه سراشيا مارسه‌سنس PTCC 1111
1-1- اهميت مسأله
بيماري سرطان يكي از معضلات اصلي طب كنوني و از علل عمده مرگ و مير در جهان است. لذا با توجه به گسترش انواع سرطان ها در جوامع بشري امروزي، شناسايي تارگت هاي جديد و طراحي و توسعه عوامل شيمي درماني اختصاصي تر دو هدف بسيار مهم در تحقيقات به منظور يافتن داروهاي ضد سرطان با اثر بخشي بيشتر و سميت كمتر مي باشد.يك خانواده از پيگمان هاي قرمز رنگ توسط گروهي از باكتري ها از جمله سراشيا مارسه سنس توليد مي شود كه اخيراً اثرات بيولوژيكي مختلفي مانند اثرات ضد باكتريايي، ضد قارچي، ضد پروتوزوآيي و سميت سلولي بر روي برخي از رده هاي سلول هاي سرطاني مانند سرطان كولون، پستان ،ريه و ... براي آنها گزارش شده است (1).
تحقيقات انجام شده حاكي از آن است كه اين پيگمان ها باعث افزايش مرگ سلولي به صورت اختصاصي (آپاپتوز) در سلول هاي سرطاني مي شوند، در حالي كه هيچ گونه سميت بارزي روي سلول هاي غير بدخيم ندارند. با توجه به خصوصيات ضد سرطاني اين خانواده انستيتو ملي سرطان (NCI) هم اثرات سايتوتوكسيك تركيبات طبيعي اين خانواده را تاييد كرده است(2).از آنجايي كه با استفاده از ميكروارگانيسم ها مي توان به داروهاي ضد سرطاني با اثرات اختصاصي تر و سميت كمتر براي انسان دست يافت كه روش هاي توليد آنها نيز مقرون به صرفه مي باشد لذا توليد، خالص سازي و تعيين ساختمان پيگمان توليد شده توسط سويه سراشيا مارسه- سنس1111 PTCCكه بومي ايران مي باشد و بررسي اثرات سميت سلولي آن بر روي برخي رده هاي سلول هاي سرطاني به منظور توسعه داروهايي با پتانسيل بالاي درمان سرطان از اهميت و ضرورت خاصي برخوردار مي باشد.
فهرست مطالب
خلاصه فارسي 3
فصل اول 6
كليات 6
فصل اول : كليات 6
1-1- اهميت مسأله 6
1-2- بيان مسأله 9
1-3- اهميت موضوع 11
فصل دوم:بررسي متون و مطالعات ديگران در اين زمينه 13
2-1- با سيل هاي گرم منفي روده اي (انتروباكترياسه) 13
2-1-2- طبقه بندي 14
2-1-3- اهميت انتروباكترياسه 15
2-1-4- مورفولوژي و شناسايي 16
2-1-5- صفات كشت 16
2-1-6- صفات بيوشيميايي 18
جدول 2-1 صفات بيوشيميايي در جنس هاي مهم از خانواده انتروباكترياسه 18
2-1-7- ساختمان آنتي ژني 19
شكل 2-1 – اجزاي آنتي ژني در انتروباكترياسه 19
2-1-8- كلي سين ها (باكتريوسين ها) 19
2-1-9- بيماري هاي ايجاد شده توسط انتروباكترياسه هايي غير از سالمونلا و شيگلا 20
2-2- سراشيا مارسه سنس(Serratia marcescens) 21
2-2-1- خصوصيات ظاهري 21
شكل 2-2- باسيل هاي گرم منفي سراشيا مارسه سنس 24
شكل 2-3- تصوير ميكروسكوپ الكتروني سراشيا مارسه سنس 24
2-2- 3- خصوصيات كشت 24
شكل 2-4- توليد پيگمان قرمز رنگ توسط سراشيا مارسه سنس در محيط كشت آگاردار 25
2-2-4- خواص بيوشيميايي 25
2-2-6- بيوسنتز پيگمان توسط سراشيا مارسه سنس 26
2-3- عوامل موثر بر توليد پيگمان توسط سراشيامارسه سنس 31
2-3-1- دما 32
2-3-2- شرايط روشنايي : 33
2-3-3- حضور آنتي بيوتيك ها 34
2-3-4-2- منبع كربن 35
نمودار 2-3- تجمع پيگمان توسط سراشيامارسه سنس در محيط حاوي : گليسيرول (-) و استات (●) 36
2-3-4-3- فسفات معدني 38
2-3-5- فعاليت تنفسي 39
2-4- خصوصيات پيگمان توليد شده توسط سراشيا مارسه سنس 39
2-5- سرطان 42
2-5-2- تعريف سرطان 43
2-5-3- نامگذاري سرطان 44
2-5-4- چرخه سلولي 44
2-5-5- علل سرطان 47
2-5-6- روش هاي درمان سرطان 47
2-5-6-1- شيمي درماني 47
2-5-6-1-1- داروهاي ضد سرطان (آنتي نئوپلاستيك) 48
2-5-7- مقاومت در برابر داروهاي سايتوتوكسيك 49
2-5-8- روش هاي غربال كردن داروهاي ضد سرطاني 50
2-6- كليات كشت سلول 52
2-6-1- مزايا و معايب كشت سلولي 52
2-6-2- آزمايش هاي بررسي رشد و سميت سلولي 53
2-6-2-1- احياي رنگ هاي تترازوليوم 55
2-6-2-2 آزمون MTT 55
2-6-2-3- Trypan blue exclusion test 60
2-6-3- تجهيزات آزمايشگاه كشت سلولي 61
فصل سوم : مواد و روش‌ها 65
3-1- دستگاه‌ها و مواد مورد نياز جهت توليد، استخراج، خالص‌سازي و تعيين ساختمان پيگمان 65
3-1-1- دستگاه‌ها 65
3-1-2- مواد و محيط هاي كشت 66
3-1-2-1- مواد شيميايي 66
3-1-2-2- محيط‌هاي كشت 67
3-1-3- ميكروارگانيسم 67
3-2-1- كشت و فعال‌سازي باكتري 67
3-2-2- كشت باكتري در محيط كشت نوترينت براث و گرمخانه‌گذاري در شرايط مناسب جهت توليد پيگمان 68
3-2-3- جداسازي سلول‌هاي باكتري از محيط كشت و استخراج پيگمان با استفاده از حلال آلي 68
3-2-3-1- روش قليايي جهت استخراج پيگمان 68
3-2-3-2- روش اسيدي جهت استخراج پيگمان 69
3-2-4- بررسي خلوص پيگمان استخراج شده به كمك كروماتوگرافي لايه نازك (TLC) 70
3-2-4-1- سيستم حلال مناسب جهت TLC 70
3-2-4-2- ظاهر كردن و مشاهده لكه‌ها 71
3-2-5- خالص‌سازي پيگمان استخراج شده از سلول‌هاي باكتري 71
3-2-5-1- جداسازي فازها با استفاده از قيف دكانتور 71
3-2-6- بررسي خلوص پيگمان خارج شده از ستون 74
3-2-7- تعيين ساختمان پيگمان خالص شده با روش‌هاي دستگاهي 74
3-2-7-1- طيف سنجي مرئي و ماوراء بنفش 75
Resonance(NMR) Nuclear Magnetic 76
3-3- وسايل، مواد و دستگاه‌هاي مورد نياز جهت انجام آزمايشات كشت سلولي 79
3-4- آماده‌سازي محلول‌ها جهت كشت سلولي 82
3-4-1- آماده‌سازي محيط كشت 82
جدول 3-1 : اجزاي محيط كشت RPMI-1640 84
3-4-2- آماده سازي سرم جنين گاوي (FBS) 85
جدول 3-2 : اجزاء اصلي سرم (FBS) 86
جدول 3-3 : ديگر اجزاء ضروري سرم براي حيات و رشد سلولي در محيط خارج از بدن (60) 87
3-4-3- آماده سازي محلول‌هاي پني سيلين G و استرپتومايسين 87
3-4-4- آماده‌سازي بافر PBS 88
3-4-5- آماده‌سازي رنگ تريپان بلو 89
3-4-6- آماده سازي محلول x1 تريپسين- EDTA 89
3-4-7- آماده‌سازي محلول MTT 90
3-4-8- آماده سازي رقت‌هاي دوكسوروبيسين 90
3-4-9- آماده‌سازي رقت‌هاي مختلف از نمونه پيگمان تخليص شده 90
3-6- تعويض محيط كشت 92
3-7- پاساژ سلولي 93
3-8-1- توضيحاتي در مورد تانك ازت 98
3-9- شمارش مستقيم سلول‌ها به روش Trypan Blue Dye Exclusion 98
3-11- آزمايشات انجام شده 103
3-11-1- بررسي اثر غلظت‌هاي مختلف prodigiosin در مقايسه با دوكسوروبيسين بر رشد سلول‌هاي HT 29 در مدت 2، 3 و 4 روز مجاورت 103
3-11-2- بررسي اثر غلظت‌هاي مختلف prodigiosin در مقايسه با دوكسوروبيسين بر رشد سلول هاي T47D در مدت 2، 3 و 4 روز مجاورت 105
فصل چهارم : نتايج 106
4-1- تعيين ساختمان پيگمان خالص شده 106
4-1-1- طيف جذبي مرئي و ماوراء بنفش prodigiosin 106
شكل 4-2- ساختار prodigiosin 109
4-1-3- طيف LC/MS/MS ، prodigiosin 109
شكل 4-3- شكست هاي مولكول prodigiosin 110
4-2- نتايج كشت سلولي 110
4-2-1- بررسي اثر غلظت‌هاي مختلف prodigiosin در مقايسه با دوكسوروبيسين بر رشد سلول‌هاي HT29 در مدت 2، 3 و 4 روز مجاورت 111
نمودار 4-1- اثر غلظت هاي مختلف Prodigrosin در مقايسه با دوكسوروبيسين بر رشد سلول هاي HT29 در مدت 2، 3 و 4 روز مجاورت 112
نمودار 4-2- اثر غلظت هاي مختلف Prodigrosin در مقايسه با دوكسوروبيسين بر رشد سلول هاي T47D در مدت 2، 3 و 4 روز مجاورت 114
فصل پنجم: بحث و نتيجه گيري 116
Abstract 124
منابع: 125
ضمايم 133
توضيحات بيشتر و دانلود
صدور پيش فاكتور، پرداخت آنلاين و دانلود